На главную Написать письмо редактору сайта Поиск по сайту
 
 
информационный стоматологический сайт
 
Главная
Новости
Новинки
Статьи
 Ортопедическая
 Терапевтическая
 Зуботехническая
 Имплантология
 Менеджмент
Фотогалерея
Форумы
Конкурс
База
Гостевая
Статистика
Вакансии
Резюме
Запись на прием
СтоматТоп
Справочник
Юмор
Рекламодателям
Поиск по сайту
Контакты
Эксперимент
ДентаВики
Каталог книг
Меценатам
Карта



Новая возможность
- чтобы быть в курсе последних обновлений, Вы можете подписаться на новости нашего сайта.
Подписаться:
E-mail:
 


Рейтинг@Mail.ru





Формирование пародонта in vivo вокруг титановых имплантатов с использованием оболочки из клеток периодонтальной связки.

Авторы:

Kaoru Washio, DDS, PhD - Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science, Tokyo Women’s Medical University, Tokyo, Japan.

Yusuke Tsutsumi, PhD - Institute of Biomaterials and Bioengineering, Tokyo Medical and Dental University, Tokyo, Japan.

Yuka Tsumanuma, DDS, PhD - Department of Periodontology, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, Tokyo, Japan.

Kosei Yano, DDS - Department of Periodontology, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, Tokyo, Japan.

Supreda Suphanantachat Srithanyarat, DDS, MSc, PhD - Department of Periodontology, Faculty of Dentistry, Chulalongkorn University, Bangkok, Thailand.

Ryo Takagi, PhD - Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science, Tokyo Women’s Medical University, Tokyo, Japan.

Shizuko Ichinose, PhD - Research Center for Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, Tokyo, Japan.

Walter Meinzer, DDS - Department of Periodontology, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, Tokyo, Japan.

Masayuki Yamato, PhD - Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science, Tokyo Women’s Medical University, Tokyo, Japan.

Teruo Okano, PhD - Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science, Tokyo Women’s Medical University, Tokyo, Japan.

Takao Hanawa, PhD - Institute of Biomaterials and Bioengineering, Tokyo Medical and Dental University, Tokyo, Japan.

Isao Ishikawa, DDS, PhD - Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science, Tokyo Women’s Medical University, Tokyo, Japan.

Источник: - Tissue Eng Part A. 2018 Aug;24(15-16):1273-1282. doi: 10.1089/ten.TEA.2017.0405.
Перевод:

Уханов М.М. - врач стоматолог ортопед.
E-mail: uhanov1@yandex.ru

http://www.datadental.ru/dent/form_1/

Введение

С тех пор, как остеоинтегрированный имплантат был разработан Branemark et al. 50 лет назад, корневидная форма имплантатов (TI) широко используется во всем мире [1]. Лечение с применением имплантатов обеспечивает хорошую жевательную функцию и эстетику зубов для пациентов. Что касается стабильности имплантатов, то концепция остеоинтеграции была признана фундаментальной для предсказуемого долгосрочного клинического успеха имплантационного лечения.

Тем не менее, сообщения о периимплантате отмечались с высокой распространенностью после 5-10 лет функционирования без систематического поддерживающего о лечения при смешанном зубном ряде. [2-4].

Одна из причин периимплантита связана с характером среды, окружающей остеоинтегрированные имплантаты. Механизм защиты организма хозяина от инфекции нарушается вокруг имплантата из-за отсутствия периодонтальной связки (PDL), которая содержит сосудистые сети [5]. Следовательно, инфекция вокруг имплантата легко распространяется на окружающую кость. Кроме того, устранение причинно-следственных факторов, в том числе бактерий и их токсичных продуктов, с поверхности имплантата трудно выполнить с помощью ежедневной домашней гигиены.

В 2010 Giannobile указал, что наличие PDL позволяет играть более динамичную роль, за пределами того, что представляет собой функционально остеоинтегрированный имплантат [6]. Имплантат, сопровождаемый пародонтальной структурой, сходной с той, что есть у естественного зуба, находился бы в более лучших условиях.

PDL-клетки обладают свойствами сходными с мезенхимальными стволовыми клетками и считаются полезным источником для восстановления тканей пародонта [7,8].

Были выполнены основные и клинические исследования с использованием клеток, полученных из PDL, в сочетании с «технологией клеточных листов» для регенерации периодонта. Результаты продемонстрировали регенерацию периодонта при введении PDL-волокон и вновь образованного цемента в пародонтальные дефекты [9-11].

В методике клеточной оболочки используется тарелка с клеточной культурой с настраиваемой поверхностью клеток, которая реагирует на изменение температуры, позволяя отделять клетки [12]. Применение этой технологии позволяет собирать клетки путем снижения температуры культуры без использования каких-либо ферментов, таких как трипсин. Взаимодействия клетка-клетка, протеины поверхности клеток и белки внеклеточного матрикса сохраняются внутри клеточного листа и позволяют его клеткам прилипать к живым тканям без наложения швов [13]. Используя эту методику, клеточные листы применяли для регенеративной терапии в различных областях [14-16]. Мы ожидаем, что технология клеточных листов будет эффективно применяться в стоматологической имплантологии.

Методы обработки поверхности имплантата были разработаны для того, чтобы улучшить состояние тканей вокруг имплантата. Для улучшения стабилизации клеток на имплантатах поверхность имплантата должна быть грубой, чтобы облегчить прикрепление клеток и вызвать формирование ткани на поверхности имплантата. Методы обработки поверхности – пескоструйная обработка и кислотное травление являются традиционными методами для создания такой пористой поверхности на материалах [17]. Сообщается также, что покрытие кальция фосфатом (CaP) улучшает прикрепление клеток [18]. По этим причинам в нашем протоколе поверхность титана была морфологически изменена путем пескоструйной обработки, кислотного травления и покрытия CaP. В настоящее время биологическая поверхность, создаваемая клетками или тканью, рассматривается как следующее поколение модифицированной поверхности имплантата [19].

В этом исследовании мы изучали: могут ли периодонтальные структуры образовываться при использовании культивируемых листов PDL-клеток на титане с морфологически измененными поверхностями в ксеногенной модели бедренной кости бестимусной крысы и модели аутологичной нижней челюсти собаки.

Материалы и методы

Животные

Бестимусные крысы (F344/NJcl-rnu/rnu, пять особей мужского пола, возрастом 5 недель; Japan Laboratory Animals, Inc., Tokyo, Japan) использовались для эксперимента по трансплантации титана с оболочками из клеток в полость костного мозга. Собаки Бигль (два кобеля, две суки, возрастом 8 месяцев, средний вес 10 кг; Institute for Animal Reproduction, Ibaraki, Japan) были использованы для эксперимента по прикреплению клеток к поверхностям титана и трансплантации титана с или без клеточных оболочек в дефект нижней челюсти. У животных были интактные зубы со здоровым пародонтом.

Все экспериментальные протоколы были одобрены Комитетом по охране животных Токийского женского медицинского университета (номер соглашения AE17-5).

Образцы зубов человека

Это исследование проводилось в соответствии с принципами Хельсинкской декларации. В независимом этическом комитете Токийского женского медицинского университета была утверждена коллекция третьих коренных моляров человека, которые рассматривались как клинические отходы и использовались для получения клеток для этого эксперимента. Собранные человеческие зубы были извлечены по различным причинам, отличным от пародонтального заболевания (ретенированный зуб, кариес, окклюзионные проблемы и т. д.), после получения информированного согласия пациентов в клинике Токийского женского медицинского университета.

B>Выделение, культивирование и подготовка человеческих PDL-клеток и клеточной оболочки

Человеческие клетки, полученные из PDL, собирали из удаленных человеческих третьих моляров. Метод получения клеток PDL был следующим [20]: удаленные зубы промывали пять раз в течение 3 минут каждый с альфа-минимальной основной средой (a-MEM, Life Technologies, Carlsbad, CA), содержащей 100U / мл пенициллина и 100 мг / мл стрептомицина (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Ткань PDL осторожно удаляли с поверхности средней трети удаленного корня скальпелем. Ткань обрабатывалась коллагеназой (NB6, 0.8PZ-U / mL, SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany) / диспазой (1200PU / мл, Sanko Junyaku, Tokyo) с энергичным встряхиванием при 37 ° C в течение 45 минут. Клетки культивировали при 37 ° С в основной среде, которая состояла из альфа-минимальной необходимой среды (Thermo Fisher Scientic, MA), 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Japan Bio Serum, Япония) и 1% пенициллина-стрептомицина (Sigma- Aldrich Japan, Япония). Изменение среды для клеточного пассажа с использованием 0,25% Trypsin1mM EDTA (Thermo Fisher Scienti) проводилось каждые 3-4 дня. При третьем пассаже клетки подвергали криоконсервированию с помощью среды для замораживания клеток (CELLBANKER 1, Zenoaq, Fukushima, Japan) при -150 ° C до использования.

Криоконсервированные клетки, полученные из PDL, оттаивали за 2 недели до трансплантации и культивировались в основной среде до достижения 80% -ного содержания. Для получения клеточных листов культивируемые человеческие клетки, полученные из PDL, распределяли с плотностью 4х104 клеток/чашку, по чашкам диаметром 35 мм с чувствительностью к температуре, поверхность которых была покрыта полиамидом (N-изопропилакриламидом) (UpCell; CellSeed, Inc., Токио, Япония). Культуральную среду заменяли после культивирования с основной средой в течение 2 дней на остеоиндуктивную среду, где в основную среду добавляли 82 мг / мл н-гидрата магниевой соли фосфата L-аскорбиновой кислоты (Wako Junyaku, Токио, Япония), 10 нМ дексаметазона (DEXART; Fuji Pharma, Тояма, Япония) и 10 мМ b-глицерофосфата (Sigma-Aldrich, MO). Остеоиндуктивную среду меняли два раза в неделю, а клетки инкубировали в течение 10 дней. Такая чувствительная к температуре поверхность позволяет клеткам размножаться таким же образом, как при культивировании на поверхностях обычных чашек при 37 ° С. Клетки отрываются от поверхности самопроизвольно, когда температура снижается ниже 32 ° С, чтобы получить «клеточный лист».

Выделение, культивирование и подготовка PDL-извлеченных клеток собаки и клеточного листа

Клетки PDL собаки извлекались из удаленных нижнечелюстных премоляров под общим наркозом. Перед удалением зуба собакам внутримышечно вводили 0,08 мг / кг медетомидина (Domitor; Nippon Zenyaku Kogyo, Fukushima, Japan) и 0,3 мг / кг мидазолама (Dormicum; Astellas Pharma, Inc., Токио, Япония) в качестве анестезирующей премедикации, а затем делали внутривенную инъекцию 1–2 мг / кг пропофола (Диприван; AstraZeneca, Осака, Япония). Устанавливалась эндотрахеальная трубка, а анестезия поддерживалась 2–4% севофлюраном (Pfizer Japan, Inc., Токио, Япония). Местная анестезия выполнялась инъекцией 2% лидокаина гидрохлорида, содержащий адреналин в концентрации 1: 80000 (ORA Injection Dental Cartridge; Showa Yakuhin Kako Co, Ltd., Токио, Япония) для уменьшения интраоперационного кровотечения. Способ сбора клеток, культивирования, и криоконсервации следовал тому же протоколу, что и с клетками, полученными из PDL человека, как описано выше. Примерно за 2 недели до трансплантации замороженные клетки PDL собак оттаивали и культивировали в основной среде. После пересева клетки размещали в чашке 4 х 104 клеток / UpCell (чашка 35-мм). Среда менялась на остеоиндуктивную среду, которая обновлялась каждые 3– 4 дня. Впоследствии был получен лист клеток PDL собаки через 5–7 дней дополнительного культивирования [10].

Экспрессия генов маркеров цемента в культивируемых человеческих PDL-производных клетках

Клетки, полученные из PDL человека (пассаж 6), культивировали, с использованием шести-луночной чашки, при плотности 3 • 104 клеток / лунку втечение 2 дней в базовой среде; затем среда была заменена на остеоиндуктивную среду в течение дополнительных 14 или 21 дней. Общую РНК выделяли с использованием QIA Shredder и Rneasy Plus Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) в соответствии с инструкцией. Для анализа экспрессии гена TaqMan, сДНК была синтезирована из 500 нг общей РНК с использованием набора для синтеза сДНК SuperScript VILO (Thermo Fisher Scientific). ПЦР в реальном времени с использованием StepOnePlus Real-Time ПЦР системы (Thermo Fisher Scientific) была выполнена в трех экземплярах с использованием образца белка цемента 1 (CEMP1; Hs04185363_s1), образца сиалопротеина кости (BSP; Hs00173720_m1) и образца b-actin (43263215E) (Thermo Fisher Scientific). Были определены уровни экспрессии иРНК относительно b-actin и рассчитаны кратные изменения, используя значения, полученные методом Дельта CT [21].

Образцы титана

В этом исследовании использовался доступный на рынке чистый титан (класс 2). Для эксперимента in vitro титановая фольга (TF) толщиной 10 мкм нарезалась в круги 5 мм в диаметре. Для трансплантации в полость костного мозна бедренной кости крысы использовался титановый стержень (TR) 1 мм в диаметре и 2-3 мм в длину. Для трансплантации в нижнюю челюсть собаки использовали титановый имплантат (TI) конической, цилиндрической формы диаметром 3,5 мм у верхнего края и 3 мм у нижнего края и длиной 8 мм. Дизайн TI, использованного в эксперименте на собаке, схож с имплантатами узкого диаметра, применяемыми в клинике, но есть различия между этими двумя видами имплантатов.

Используемые в настоящее время имплантаты имеют винтовую конструкцию, но TI не имел винтов.

Для улучшения прикрепления клеток образцы титана в экспериментальных группах были обработаны пескоструем, протравлены кислотой и покрыты CaP. Процедуры обработки поверхности выполнялись последовательно следующим образом: 1) пескоструйная обработка порошком оксида циркония с размером частиц 75-106 мкм (TZ-B90: Tosoh Corporation). 2) Травление кислотой: образец титатана погружали при комнатной температуре втечение 4 ч в раствор смешанных 1:1 неразбавленных реагентов перекиси водорода (Kanto Chemical Co.) и серной кислоты (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Затем титан был множество раз промыт ультрачистой водой. 3) Покрытие СаР: образец титана размещался в растворе Hank без глюкозы и выдерживали при температуре 37 градусов 168 часов. Затем титан промывался 70% этанолом и стерилизовался в автоклаве перед использованием.

Все образцы титана перед использованием промывались физиологическим раствором с фосфатным буфером (PBS; Thermo Fisher Scientifics) или физиологическим раствором (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc., Japan) в течение 5 минут дважды.

Прикрепление клетки к поверхности титановой фольги (TF)

После трипсинизации клеток, полученных из PDL собаки, клетки собирали в 1,5 мл пробирках (Eppendorf, Hamburg, Germany) с плотностью 4х105 клеток/500 мкл среды, а затем титановая фольга пропитывалась в пробирке. TF без обработки поверхности использовалась в качестве контроля. Пробирки с клетками и TF инкубировались при 37 градусах по Цельсию втечение 20, 40, 60 и 120 минут. После инкубации подсчитывали число клеток, оставшееся в пробирке, а количество клеток, прикрепившихся к TF, рассчитывали путем вычитания количества клеток, оставшихся в пробирке, из общего числа клеток (4х105 клеток).

Листы клеток PDL, прилипшие к TR и TI

Листы клеток были получены путем снижения температуры культуры клеток от 37 С до 32 С (при комнатной температуре от 20 до 30 С). Трехслойные клеточные листы приспосабливались к поверхности титана. Титановые образцы с клеточными листами инкубировали в основной среде при 37 ° С в течение более 1 ч перед трансплантацией и промывали PBS непосредственно перед использованием.

Трансплантация ТR с клеточной оболочкой в полость костного мозга бедренной кости крысы: сбор образцов для гистологического анализа

Под анестезией 2–3% изофлурана небольшой разрез для доступа был сделан в ноге крысы с помощью скальпеля. Коленный сустав был обнажен путем перемещения прямой мышцы бедра кнаружи от коленного сустава с помощью стоматологического экскаватора. Костный дефект диаметром 2–3 мм был сделан стоматологическим бором на межмыщелковой ямке бедренной кости крысы. После промывания дефекта физиологическим раствором, TR (с или без обработки поверхности), включая прикрепленные листы клеток, устанавливался в полость костного мозга через дефект кости. Смещенная мышца заново была перенесена на коленный сустав и разрез кожи был ушит. Через шесть недель после трансплантации крысу умерщвляли с использованием 3-4% изофлурана после анестезии с 2–3% изофлураном. Установленный ТR и покрывающие его ткани были удалены вместе с бедренной костью в качестве образца для гистологического анализа. Методика эксперимента на крысиной модели проиллюстрирована на рисунке 1А.


Рис. 1. Иллюстрация протокола эксперимента. Экспериментальная методика культивирования клеток и трансплантации в полость костного мозга бедра крысы показана на рис. (А). Экспериментальная методика культивирования клеток и трансплантации в кость нижней челюсти собаки показана на рис. (B). PDL, периодонтальная связка; EXP, экспериментальная группа.

Трансплантация TI с оболочкой из клеточных листов в кость нижней челюсти собаки: забор образцов для гистологического анализа

Через шесть месяцев после удаления донорских зубов, которые были использованы при подготовке листов из клеток, лунки после удаления полностью восстановились. Дефект кости был отпрепарирован под наркозом диаметром 4,5 мм и глубиной 10 мм. Размеры дефекта были немного больше размеров ТI. ТI с прикрепленным листом из культивированных клеток был установлен в костный дефект в области клыка нижней челюсти. После установки имплантата была размещена титановая сетка (Bone Plate ; Jeil Medical Corporation, Корея), закрепленная титановыми винтами, чтобы перекрыть и стабилизировать TI. Периостальный послабляющий разрез был выполнен, чтобы позволить пассивно перекрыть все материалы десневыми лоскутами. Прерывистый шов GORETEX (Gore Medical) был выполнен для достижения стабильности лоскута и первичного закрытия раны. Из предварительных исследований, связанных с трансплантацией TI с клеточными листами PDL собак в кость нижней челюсти собаки, мы обнаружили, что, покрывая пересаженные материалы титановой сеткой, мы смогли избежать обнажения имплантатов (данные не показаны). В контрольной группе был установлен ТI с обработкой поверхности без оболочки из клеток. Через одиннадцать недель после трансплантации собаку умерщвляли, используя хлорид калия (KCl; Терумо, Токио, Япония) под таким же наркозом, который применялся ранее во время удаления зуба. Установленный TI и покрывающая ткань удалялись вместе с костью нижней челюсти в виде блока образца для гистологического анализа. Количество TI трансплантированных вместе с клеточной оболочкой было 6. Количество TI без клеточных листов, в качестве контроля, было 4. Методика эксперимента в кости нижней челюсти собаки, в качестве модели, проиллюстрирована на рис. 1B.


Препарирование тканей и гистологическое наблюдение и измерение

Гистологическое препарирование выполнялось в коммерческой лаборатории (Kureha Special Laboratory, Tokyo, Japan, ссылка для этого метода (www.kureha-bunseki.co.jp/english/bone). Кратко, образец обезвоживался 70% этанолом, и внедрялся в метилметакрилатную пластмассу для недекальцинированного измельченного среза, метод, обычно используемый для получения срезов твердых тканей и тканей, содержащих металлические материалы. Срезы окрашивали, используя метод Villanueva–Goldner. Окрашивание может выделить кальцинированные ткани в зеленый цвет, а другие ткани (например, остеоидная и соединительная ткань и т.д.) окрашивались в красный цвет. Световой микроскоп (Eclipse E800; Nikon, Japan) использовался для морфологического наблюдения окрашенных срезов. Программное обеспечение (NIS-Elements D; Nikon) использовалось для получения фотографий и гистологического измерения. Области срезов, изученные под световым микроскопом, также пересматривались под фазово-контрастным световым микроскопом (ECLIPSE Ti; Nikon), чтобы наблюдать новообразованную фиброзную ткань морфологически.

Наблюдение с использованием трансмиссионной электронной микроскопии

Для наблюдения в просвечивающей электронной микроскопии (TEM) собранные образцы фиксировали в 2,5% глутаровом альдегиде в 0,1 М фосфатном буфере (PB) в течение 2 часов. Образцы промывались 0,1 М PB, постфиксировали в 1% OsO4 забуференном 0,1 М PB в течение 2 ч, обезвоживали в поэтапной серии этанола и встраивали в Epon 812. Полутонкие срезы были сделаны толщиной 1 мкм и окрашены толуидиновым синим. Ультратонкие срезы, 90 нм, были собраны на медных сетках, дважды окрашенных уранил ацетатом и цитратом свинца, а затем наблюдали с использованием TEM (Н-7100; Hitachi, Токио, Япония).

Статистический анализ

Все данные были представлены, как среднее значение ± стандартное отклонение. Статистический анализ гистологических измерений и данных ПЦР проводился с использованием t- теста Стьюдента. Данные из эксперимента по прикреплению клеток к поверхности титана были проанализированы односторонним повторным анализом дисперсии, после специального теста Фишера. Значение р <0,05 считали статистически значимым.

Результаты

Экспрессия генных маркеров цемента в культивируемых человеческих PDL-производных клетках

Для подтверждения способности индукции цементогенеза в полученных человеческих PDL-производных клетках, экспрессию гена CEMP1 и BSP наблюдали на 14 и 21 день культивирования с остеоиндуктивной средой. Экспрессия гена CEMP1 в клетках, полученных из PDL, наблюдаемых на 14 день, была низкой. Однако на 21-й день уровень экспрессии CEMP1 был повышен до 10 раз по сравнению с экспрессией на 14 день (рис. 2А). Уровень экспрессии BSP также также повышался на 21 день, аналогично тому, как это происходит в СЕМР1 (Рис. 2B). Результаты показали, что культивирование PDL клеток человека в остеоиндуктивной среде может повышать экспрессию генов, связанных с цементогенезом.


Рис. 2. Экспрессия цементных маркеров в клетках PDL человека. Экспрессия генов цементных маркеров, CEMP1 (A) и BSP (B) из клеток, полученных из PDL человека, культивируемых в остеоиндуктивной среде в течение 14 и 21 дней. * р <0,001. BSP, костный сиалопротеин; CEMP1, белок цемента 1. Цветные изображения доступны онлайн на www.liebertpub.com/tea .

Присоединение клеток, полученных из PDL собак к титановой фольге (TF) с или без обработки поверхности

Для того, чтобы исследовать подходящую поверхность титана для прикрепления клеток, полученные из PDL собак, клетки инкубировали с TF с или без обработки поверхности. Количество прикрепленных клеток на обеих титановых поверхностях увеличивалось в зависимости от времени, и более половины от нанесенных клеток прикрепилось за 120 мин на оба типа поверхности (рис. 3). Значительное ускорение прикрепления клеток на обработанной поверхности титана наблюдалась через 40 мин по сравнению с контрольной (необработанной) поверхностью титана (р <0,05) (рис. 3).


Рис. 3. Клетки, полученные из PDL, быстрее прикрепляются к TF с обработкой поверхности. На этом рисунке показано количество клеток, прикрепленных к поверхности TF без и с кислотным травлением, пескроструйной обработкой и покрытием CaP. Временные точки показывают период культивирования клеток PDL с TF. CTL (белая полоса) показывает контрольную группу с использованием ТF без обработки поверхности; EXP (черная полоса) показывает экспериментальную группу, использующую TF с обработкой поверхности. (р <0,05). CaP, фосфат кальция; CTL, контрольная группа; TF, титановая фольга.

Трансплантация TR с листами из человеческих PDL-производных клеток в полость костного мозга бедренной кости крысы

Для подтверждения прикрепления клеток и формирования подобные пародонту тканей на титане из человеческих PDL-производных клеток in vivo, мы трансплантировали TR с листами из человеческих PDL-производных клеток в полость костного мозга бедренной кости бестимусной крысы на период 6 недель. В опытной группе с использованием ТR с обработкой поверхности и прикрепленными клеточными листами из PDL-производных клеток, трансплантированные листы клеток PDL оставались на поверхности TR, были окрашены в красный цвет, и наблюдались между TR и новообразованной костью примерно на половине поверхности TR (рис. 4А (а)). Цементоподобная твердая ткань (зеленая стрелка) и PDL-подобные фиброзные ткани (красная стрелка) наблюдались в области, окрашенной красным, на поверхности ТР (рис. 4А (b)). В контрольной группе, использующей TR без обработки поверхности и с прикрепленными клеточными листами из PDL-производных клеток, трансплантированные листы из PDL клеток отделялись от поверхности TR, а остеоинтеграция произошла почти полностью вокруг поверхности TR (рис. 4A (с)). Клетки костного мозга заполнили окрашенную красным цветом область между TR и новой костью, но похожая на пародонт ткань редко наблюдалась в контрольной группе (рис. 4A (d)).

Длина прикрепленного клеточного листа и вновь сформированной PDL-подобной ткани на поверхности TR была измерена для статистического сравнения эффекта обработки поверхности титана. Существует тенденция к увеличению прикрепления клеток к TR с обработкой поверхности по сравнению с контролем без обработки поверхности (рис. 4B (а)). Кроме того, образование PDL-подобной ткани, наблюдаемое на поверхности TR с обработкой, имело тенденцию к увеличению по сравнению с контрольной поверхностью (рис. 4B (b)), хотя эти различия не были статистически значимыми.


Рис. 4. Трансплантация TR и клеточных листов из человеческих PDL-производных клеток в модель в полость костного мозга крысы индуцировало образование пародонтообразной структуры на поверхности титана. (A) Гистологические результаты трансплантации комплекса ТR (с обработкой поверхности: экспериментальная группа (а, б); или без обработки поверхности: контрольная группа (c, d)) и клеточных листов из человеческих PDL-производных клеток в течение 6 недель. (b, d) увеличенное изображение квадратной области (а, c). Зеленая стрелка, недавно cформированная цементоподобная ткань; Красная стрелка, недавно сформированная PDL-подобная ткань. (B) Сравнение длины сформированной ткани наблюдали путем гистологического исследования. (а) Соотношение длины поверхности титана покрытой листами клеток PDL со всей длиной поверхности титана (b) Соотношение длины титана c PDL на поверхности c общей длиной поверхности титана. CTL группа (белые полосы); EXP группа (черные полосы). Черта указывает 1 мм (a, c) и 50 мкм (b, d). NB, недавно сформированная кость; Ti, титан; ТR, титановый стержень. Цветные изображения доступны онлайн на www.liebertpub.com/tea

Наблюдение за новообразованной тканью на титане с использованием просвечивающей электронной микроскопии (TEM)

Для дальнейшего распознавания регенерированной ткани на обработанной поверхности титана было выполнено наблюдение с использованием просвечивающей электронной микроскопии. Зона наблюдения с регенерированной тканью была подтверждена с помощью световой микроскопии (рис. 5А). Результаты показали, что кальцинированный слой, содержащий цементобластоподобные клетки и богатый гидроксиапатитом, существовал рядом с обработанной поверхностю титана, а PDL-подобная ткань наблюдалась на кальцинированном слое (рис. 5В).


Рис. 5. Наблюдение за вновь сформированной тканью на титане с использованием просвечивающей электронной микроскопией. Регенерированная ткань вначале изучалась с помощью светового микроскопа (А). Красный квадрат в (A) показывает область расположения (B). (B) TEM изображение регенерировавшей ткани. HAp, кристалл гидроксилапатита; Cell, ядро цементобластоподобной клетки; ТЕМ, просвечивающая электронная микроскопия. Цветные изображения доступны онлайн на www.liebertpub.com/tea

Трансплантация TI с клеточными листами PDL-производных клеток собаки

Три имплантата с обработкой поверхности и присоединенными клеточными листами PDL (экспериментальная группа) и два имплантата с обработкой поверхности, но без клеточных листов (контрольная группа), были успешно зафиксированы внутри костных дефектов. В экспериментальной группе два из трех имплантатов успешно сохранили листы клеток вокруг поверхности TI. На гистологическом наблюдении через 11 недель после трансплантации видно, что образовались окрашенные красным мягкие ткани между титаном и костью нижней челюсти (рис. 6А). В области близкой к кости нижней челюсти PDL-подобная ткань (P) была ориентирована перпендикулярно к поверхности титана, также как наблюдаемая цементоподобная ткань (CO) и кровеносный сосуд (BV) (рис. 6A оранжевый квадрат, 6B и 6E). В контрольной группе преобладала остеоинтеграция на поверхности титана (рис. 6 C, D).


Рис. 6. Трансплантация TI с клеточным листом в костные дефекты нижней челюсти собаки. Гистология трансплантированного TI и окружающих тканей через 11 недель после трансплантации. Экспериментальная группа была пересажена, как TI с обработкой поверхности и с прикрепленными клеточными листами, полученными из PDL собаки (A, B). Контрольная группа была пересажена, как TI с обработкой поверхности, но без клеточных листов (C, D). (A, C) Демонстрирует общее изображение, а (B) показывает увеличенные изображения из оранжевого квадрата в (А). (D) Показывает увеличенное изображение синего квадрата в (С). (E) Показывает изображение с помощью фазово-контрастного микроскопа. Черная масштабная линия показывает 1 мм в (A, C), а белая линия показывает 50 мм в (B, D). TI, титановый имплантат; NB - альвеолярная кость; BV, кровеносный сосуд; CO - цементоподобная ткань; P, PDL-подобная ткань. Цветные изображения доступны онлайн на www.liebertpub.com/tea

Обсуждение

Наличие PDL помогает защитить от инфекции и помогает защитить от резорбции кости, связанной с механическим напряжением, таким как, например, при окклюзионной нагрузке и ортодонтическим движением зубов. Эти преимущества способствуют поддержанию высоты альвеолярного отростка [22].

Клетки, полученные из PDL, способны к регенерации пародонта, в том числе индукция цемента. CEMP1 был идентифицирован, как один из генов маркера цемента, как выяснилось, экспрессируется в цементобластах, клетках PDL и клетках, расположенных вокруг сети сосудов [23,24]. В этом исследовании экспрессия CEMP1 была подтверждена для клеток PDL, культивируемых с остеоиндуктивной средой втечение 21 дня. Это свидетельствует о том, что полученные клетки PDL обладают способностью индуцировать цементогенез. В нашем протоколе клеточный лист был пересажен с TI после 14 дней культивирования. Наши результаты показывают, что клеточный лист обладает способностью вызывать образование цемента после пересадки. Некоторые исследования показывают, что уровень экспрессии CEMP1 в клетках PDL человека зависит от условий культивирования [25,26]. Таким образом, дальнейшие исследования должны проводится, чтобы найти наиболее подходящие условия культивирования для ускорения образования цемента и PDL на TI.

Исследователи ожидают развития тканей пародонта на титановой поверхности, используя преимущества нескольких атрибутов клеток PDL. Возможность образования новой ткани пародонта вокруг имплантатов исследуется с 1990 года, когда первоначальные наблюдения предполагали возможность достижения закрепления зубного имплантата с PDL [27]. Впоследствии, много исследований было проведено на комбинации стоматологических имплантатов и тканей пародонта [28–30], и на методиках культивирования клеток вокруг имплантатов с использованием биоинженерии [31,32], а также тканевой инженерии [22,33,34]. Различные методики исследовались с конечной целью получения плотной и стабильной границы соприкосновения между имплантатом и тканями PDL.

В этом исследовании мы сфокусировались на «клеточной листовой инженерии», потому что надежное крепление клеток на поверхности титана необходимо для более биологически стабильной поверхности имплантата. По этой технологии уже получают ткани из клеток без каких-либо каркасов [35,36] и об эффективности листов из клеток PDL, культивированных в остеоиндуктивной среде, для регенерации пародонта на поверхности дентина, уже сообщалось [10,13].

Кроме того, недавно сообщалось, что пересаженный клеточный лист PDL с поликапролактоновым каркасом, покрытым CaP, в модель дефекта пародонта крысы, способствует образованию нового пародонтального прикрепления [37]. Это открытие соответствует нашим результатам in vivo, что листы клеток PDL индуцировали PDL-подобную ткань на поверхности титана с обработкой, включая покрытие CaP.

Уже сообщалось, что CaP покрытие обладает способностью ускорять кальцификации из остеобластов, используя каркасы [38,39]. Кроме того, как показано на рис. 3 через 40 мин после начала инкубации, и согласно нашим пробным экспериментам с обработкой поверхности (данные не показаны), предполагается, что прикрепление PDL клеток на титановой поверхности улучшалось при CaP покрытии. Это улучшение может помочь индуцировать образование цементо-подобной ткани на поверхности титана. В наших экспериментах, структура PDL-подобной фиброзной ткани соединенной с цементоподобным слоем была схожа с натуральной тканью пародонта.

В экспериментах на бестимусных крысах с человеческими клетками PDL, различия в соотношении покрытия клеточным листом и в соотношении образования PDL между контрольной и экспериментальной группами не были статистически значимыми. Это несоответствие между статистическим анализом и гистологическим наблюдением могло быть из-за изменчивости данных измерений. Кроме того, расположение и подвижность ТR в бедре крысы могло отрицательно сказаться на стабильности прикрепления клеточных листов и образовании пародонто-подобной ткани на поверхности титана.

Поскольку модель бестимусной крысы полезна для оценки достоверности регенерации человеческих клеток, мы выбрали ее, чтобы оценить образования тканей пародонта, индуцированных клеточными листами из PDL клеток человека. Необходимо было также подтвердить, что вновь сформированные волокна PDL встраиваются между кальцифицированной тканью на титане и костью, со структурой, подобной той, что наблюдается у естественной периодонтальной ткани, а бедренная кость крысы подходит для наблюдения за образованием кальцинированной ткани из-за ее богатого кровоснабжения и губчатой кости.

Однако, так как бедро и нижняя челюсть развиваются через различные процессы оссификации, чтобы помочь перевести наш эксперимент к будущей клинической ситуации, мы решили использовать аутологичную модель нижней челюсти собаки с соответствующим протоколом.

На контрольной модели собаки, чтобы исключить влияние образования пародонто-подобных тканей, связанное с прикрепленными клеточными листами из PDL клеток, вместе с имплантатом клеточные листы не пересаживались. В экспериментальной группе, наблюдалась вновь образованная пародонтальная ткань между имплантатами и костью. С другой стороны, остеоинтеграция, которая является современным методом для стабилизации имплантатов, происходила в контрольной группе.

При остеоинтеграции имплантаты соединяются непосредственно с альвеолярной костью, как анкилоз, без соответствующих преимуществ и функций естественноой PDL. Основные функции PDL – это поглощение окклюзионной нагрузки и удержание высоты альвеолярной кости. Клетки PDL образуют цемент и обеспечивают питательное снабжение цемента, которое способствует удержанию высоты альвеолярной кости. Клинически, ортодонтическое движение зуба, несъемные протезы с опорой на зубы и пародонтальная регенеративная терапия зависят от функций PDL. Кроме того, ткани PDL имеют много сосудистых капилляров. Такое кровоснабжение помогает индуцировать местный иммунологический защитный механизм, чтобы действовать против внешних вредных раздражителей, таких как бактериальная инфекция. Таким образом, мы предположили, что имплантат с PDL подобной тканью будет помогать предотвратить периимплантит.

Последние сообщения делают ясным, что периимплантит не является редкостью после имплантации, и что он считается существенной и растущей проблемой в стоматологии [3,40]. Одна из причин этих осложнений связана с природой существующих систем имплантатов, которые зависят от остеоинтеграции без преимуществ PDL-подобной структуры, как обсуждалось выше. Следовательно, формирование пародонто-подобной ткани в соединении с TI имеет потенциальные преимущества, аналогичные тем, что существуют вокруг естественного зуба.

Заключение

Это исследование показало, что образование пародонто-подобной ткани произошло при использовании культивированных клеточных листов PDL на титановой поверхности, в сочетании с кислотным травлением, пескоструйной обработкой и CaP покрытием в ксеногенной модели бедренной кости крысы и в аутологичной модели нижней челюсти собаки. Вновь образованная ткань содержит внедренные PDL-подобные волокна и вновь сформированную цементо-подобную ткань, которые структурно схожи с тем, что обнаружено в тканях пародонта вокруг естественного зуба. Клиническое применение биоинженерных имплантатов с PDL подобной тканью, как ожидается, представляет альтернативную терапевтическую методику имплантации, позволяя создать более естественный и стабильный зубной ряд на всю жизнь.

Список литературы:

1. Branemark, P.I., Adell, R., Breine, U., Hansson, B.O., Lindstrom, J., and Ohlsson, A. Intra-osseous anchorage of dental prostheses. I. Experimental studies. Scand J Plast Reconstr Surg 3, 81, 1969.

2. Koldsland, O.C., Scheie, A.A., and Aass, A.M. Prevalence of peri-implantitis related to severity of the disease with different degrees of bone loss. J Periodontol 81, 231, 2010.

3. Derks, J., Schaller, D., Hakansson, J., Wennstrom, J.L., Tomasi, C., and Berglundh, T. Effectiveness of implant therapy analyzed in a Swedish population: prevalence of peri-implantitis. J Dent Res 95, 43, 2016.

4. Lindhe, J., and Meyle, J. Peri-implant diseases: consensus report of the sixth European workshop on periodontology. J Clin Periodontol 35, 282, 2008.

5. Ericsson, I. Chapter1, biology and pathology of peri-implant soft tissues. In: Palacci, P., ed. Optimal Implant Positioning & Soft Tissue Management for the Branemark System. Berlin, Germany: Quintessence Publishing, 1995, pp. 11–20.

6. Giannobile, W.V. Getting to the root of dental implant tissue engineering. J Clin Periodontol 37, 747, 2010.

7. Seo, B.M., Miura, M., Gronthos, S., et al. Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament. Lancet 364, 149, 2004.

8. Nagatomo, K., Komaki, M., Sekiya, I., et al. Stem cell properties of human periodontal ligament cells. J Periodontal Res 41, 303, 2006.

9. Iwata, T., Yamato, M., Zhang, Z., et al. Validation of human periodontal ligament-derived cells as a reliable source for cytotherapeutic use. J Clin Periodontol 37, 1088, 2010.

10. Tsumanuma, Y., Iwata, T., Washio, K., et al. Comparison of different tissue-derived stem cell sheets for periodontal regeneration in a canine 1-wall defect model. Biomaterials 32, 5819, 2011.

11. Iwata, T., Washio, K., Yoshida, T., et al. Cell sheet engineering and its application for periodontal regeneration. J Tissue Eng Regen Med 9, 343, 2015.

12. Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., and Sakurai, Y. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly(N-isopropylacrylamide). J Biomed Mater Res 27, 1243, 1993.

13. Ishikawa, I., Iwata, T., Washio, K., et al. Cell sheet engineering and other novel cell-based approaches to periodontal regeneration. Periodontol 2000 51, 220, 2009.

14. Ohki, T., Yamato, M., Ota, M., et al. Prevention of esophageal stricture after endoscopic submucosal dissection using tissue-engineered cell sheets. Gastroenterology 143, 582, 2012.

15. Nishida, K., Yamato, M., Hayashida, Y., et al. Corneal reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium. N Engl J Med 351, 1187, 2004.

16. Miyagawa, S., Domae, K., Yoshikawa, Y., et al. Phase I clinical trial of autologous stem cell-sheet transplantation therapy for treating cardiomyopathy. J Am Heart Assoc 6, e003918, 2017.

17. Hanawa, T. A comprehensive review of techniques for biofunctionalization of titanium. J Periodontal Implant Sci 41, 263, 2011.

18. Tsutsumi, Y., Nishimura, D., Doi, H., Nomura, N., and Hanawa, T. Difference in surface reactions between titanium and zirconium in Hanks’ solution to elucidate mechanism of calcium phosphate formation on titanium using XPS and cathodic polarization. Mater Sci Eng C 29, 1702, 2009.

19. Hanawa, T. Biofunctionalization of metallic materials: creation of biosis-abiosis intelligent interface. In: Sakaki, K.S.O., and Takahashi N, ed. Interface Oral Science 2014, Innovation Research on Biosis-Abiosis Intelligent Interface. New York: Springer, 2015, p. 53.

20. Washio, K., Iwata, T., Mizutani, M., et al. Assessment of cell sheets derived from human periodontal ligament cells: a pre-clinical study. Cell Tissue Res 341, 397, 2010.

21. Livak, K.J., and Schmittgen, T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods 25, 402, 2001.

22. Nakajima, K., Oshima, M., Yamamoto, N., et al. Development of a functional biohybrid implant formed from periodontal tissue utilizing bioengineering technology. Tissue Eng Part A 22, 1108, 2016.

23. Hoz, L., Romo, E., Zeichner-David, M., et al. Cementum protein 1 (CEMP1) induces differentiation by human periodontal ligament cells under three-dimensional culture conditions. Cell Biol Int 36, 129, 2012.

24. Alvarez-Perez, M.A., Narayanan, S., Zeichner-David, M., Rodriguez Carmona, B., and Arzate, H. Molecular cloning, expression and immunolocalization of a novel human cementum-derived protein (CP-23). Bone 38, 409, 2006.

25. Komaki, M., Iwasaki, K., Arzate, H., Narayanan, A.S., Izumi, Y., and Morita, I. Cementum protein 1 (CEMP1) induces a cementoblastic phenotype and reduces osteoblastic differentiation in periodontal ligament cells. J Cell Physiol 227, 649, 2012.

26. Gauthier, P., Yu, Z., Tran, Q.T., Bhatti, F.U., Zhu, X., and Huang, G.T. Cementogenic genes in human periodontal ligament stem cells are downregulated in response to osteogenic stimulation while upregulated by vitamin C treatment. Cell Tissue Res 368, 79, 2017.

27. Buser, D., Warrer, K., and Karring, T. Formation of a periodontal ligament around titanium implants. J Periodontol 61, 597, 1990.

28. Choi, B.H. Periodontal ligament formation around titanium implants using cultured periodontal ligament cells: a pilot study. Int J Oral Maxillofac Implants 15, 193, 2000.

29. Jahangiri, L., Hessamfar, R., and Ricci, J.L. Partial generation of periodontal ligament on endosseous dental implants in dogs. Clin Oral Implants Res 16, 396, 2005.

30. Parlar, A., Bosshardt, D.D., Unsal, B., Cetiner, D., Haytac, C., and Lang, N.P. New formation of periodontal tissues around titanium implants in a novel dentin chamber model. Clin Oral Implants Res 16, 259, 2005.

31. Gault, P., Black, A., Romette, J.-L., et al. Tissue-engineered ligament: implant constructs for tooth replacement. J Clin Periodontol 37, 750, 2010.

32. Lin, Y., Gallucci, G.O., Buser, D., Bosshardt, D., Belser, U.C., and Yelick, P.C. Bioengineered periodontal tissue formed on titanium dental implants. J Dent Res 90, 251, 2011.

33. Oshima, M., Inoue, K., Nakajima, K., et al. Functional tooth restoration by next-generation bio-hybrid implant as a bio-hybrid artificial organ replacement therapy. Sci Rep 4, 6044, 2014.

34. Lee, D.J., Lee, J.M., Kim, E.J., et al. Bio-implant as a novel restoration for tooth loss. Sci Rep 7, 7414, 2017.

35. Okano, T., Yamada, N., Okuhara, M., Sakai, H., and Sakurai, Y. Mechanism of cell detachment from temperaturemodulated, hydrophilic-hydrophobic polymer surfaces. Biomaterials 16, 297, 1995.

36. Yamato, M., Utsumi, M., Kushida, A., Konno, C., Kikuchi, A., and Okano, T. Thermo-responsive culture dishes allow the intact harvest of multilayered keratinocyte sheets without dispase by reducing temperature. Tissue Eng 7, 473, 2001.

37. Dan, H., Vaquette, C., Fisher, A.G., et al. The influence of cellular source on periodontal regeneration using calcium phosphate coated polycaprolactone scaffold supported cell sheets. Biomaterials 35, 113, 2014.

38. Vaquette, C., Fan, W., Xiao, Y., Hamlet, S., Hutmacher, D.W., and Ivanovski, S. A biphasic scaffold design combined with cell sheet technology for simultaneous regeneration of alveolar bone/periodontal ligament complex. Biomaterials 33, 5560, 2012.

39. Vaquette, C., Ivanovski, S., Hamlet, S.M., and Hutmacher, D.W. Effect of culture conditions and calcium phosphate coating on ectopic bone formation. Biomaterials 34, 5538, 2013.

40. Atieh, M.A., Alsabeeha, N.H., Faggion, C.M., Jr., and Duncan, W.J. The frequency of peri-implnat diseases: a systematic review and meta-analysis. J Periodontol 84, 1586, 2013.

Copyright by Dental-revue © 2001